上北京哪家医院里治疗白癜风最好最有效 http://www.zgbdf.net/baidianfengjiankangzixun/gedijiankang/m/4499.html《Creationofbladderassembloidsmimickingtissueregenerationandcancer》Nature;SouthKorea;13October
此Paper结合了类器官、iPSC、3D打印、单细胞测序......
Fig.1重建三维膀胱组合体
A：三层膀胱组合体与wild-type膀胱相比的代表性图像。虚线划定上皮和基质之间的边界，以及基质和肌肉层的边界。蓝色为DAPI染色（中间）。标尺，μm（上图和下图）和20μm（中间）。
B-D,F：膀胱组合体上皮和基质细胞增殖的定量。
B：Col1a2CreERmice的膀胱组合体。
C：没有经tamoxifen治疗的Smofl/flmice的膀胱组合体。
D：tamoxifen治疗后的Smofl/flmice的膀胱组合体。
F：人类的组织制备的膀胱组合体。
E：人类三层膀胱组合的代表性图像。虚线划定上皮和基质之间的边界，以及基质和肌肉层的边界。标尺，μm。数据是平均±s.e.m。统计，样本大小(N)和重复的次数在方法中显示，“统计和重现性’。
Fig.2膀胱组合能模仿成年膀胱的功能和人类尿路感染UTI。
A：wide-type膀胱、1天组合体和7天组合体的scRNA-seq数据的t-Distributedstochasticneighborembedding(t-SNE)图。每个样本中的每个集群已标注。
B：使用在每个细胞群体中的全部标记基因获得皮尔逊相关系数(PCC)。
C：膀胱类器官体的肌肉层收缩和肌肉细胞收缩定量。Ach,乙酰胆碱;Ctrl,control;NA,去甲肾上腺素。
D：使用含Ca或者不含Ca测试小鼠膀胱类器官体尿路上皮屏障功能。
E:使用含Ca或者不含Ca测试人膀胱类器官体尿路上皮屏障功能，虚线区分上皮层和基质层。
F：wide-type膀胱UTI上皮细胞和基质细胞增殖的定量。
G：膀胱类器官体的上皮细胞和基质细胞增殖的定量。
H：野生型膀胱的上皮和基质表达Gli1，Wnt2，Wnt4的情况。
I：膀胱类器官体的上皮和基质表达Gli1，Wnt2，Wnt4的情况。
Fig.3肿瘤组合体能概括人尿路上皮癌的病理生理学特征。
A：P-1（Iuminal管腔样类型）来自侵袭性尿路上皮癌患者的肿瘤类器官、肿瘤组合体、Xenograft和亲本肿瘤的组织病理学特征。
B：P-2（basal基底样类型）来自侵袭性尿路上皮癌患者的肿瘤类器官、肿瘤组合体、Xenograft和亲本肿瘤的组织病理学特征。
C：肿瘤类器官(O)和肿瘤组合体(A)中检测到的突变与相应的亲本肿瘤的一致性。
D：肿瘤亚型漂移在不同样本中的总结。
E：SAG或者FK处理后的膀胱肿瘤组合体中的肿瘤细胞数变化情况。
F：膀胱肿瘤类器官和肿瘤组合体的剂量-反应曲线。
G：基于3D打印的重建过程的流程图，以产生膀胱肿瘤组合体。
H：浸润性尿路上皮癌患者膀胱肿瘤组合肌肉侵袭性的定量。。
I：加入肿瘤反应T细胞后肿瘤面积变化。
J：加入肿瘤反应T细胞后肿瘤凋亡情况。
Fig.4确定了人尿路上皮癌的亚型的plasticity（差异）是通过FOXA1-BMP-hedgehogaxis轴。
A：在管腔型样本细胞中染色质accessibility（易接近）增加和H3K27ac信号增加的区域富集。
B：免疫荧光显示FOXA1在四种细胞系中产生的肿瘤组合体的表达情况，蓝色DAPI染色，Scalebars,μm。
C：在不同类型肿瘤组合体中的FOXA1免疫荧光及相对表达量。
D、F：BASE47和MDACC分类器分析所示样本的分子亚型。
E、G、J、K：使用测序（ATAC-seq），H3K27ac染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和FOXA1ChIP-seq信号跨指定样品中GAIN区域等方法获得Metagene表示转座酶可及染色质的平均测定。
H、I：所示样品中FOXA1的相对表达。
L：模型显示来自CAF的BMP信号诱导肿瘤细胞中的FOXA1表达，其作为主要调节因子起作用，驱动增强子重编程以赋予肿瘤亚型plasticity。
ExtendDataFig.1单细胞来源的膀胱类器官通过短期连续传代或长期培养维持一年以上。
A：图示小鼠正常膀胱类器官短期和长期培养的实验策略。
B：time-course图像显示单个尿路上皮细胞成功地产生了膀胱类器官。标尺，μm。
C：在每代培养第9天时，类器官大小的量化。
D：每代类器官形成效率的量化。
E：第1代到第20代连续传代短期（第9天）膀胱器官的明场图像。标尺，μm。
F：用明场图像和免疫荧光分析连续传代短期（1-18天）膀胱类器官的代表性图像。标尺，μm。
G：长期培养的膀胱类器官在指定日期的平均大小。
H：在长期培养过程中，膀胱类器官在指定时间的代表性图像，用明场图像和免疫荧光分析。标尺，μm。
I：短期（第14天)和长期(第81天）的类器官，与胚胎(E16)膀胱和成人(P8周)膀胱相比。虚线划定上皮和基质之间的边界（白色箭头，伞状细胞），Scalebars,20μm。
J：Upk2、Upk1a、Foxa1和Gata3在长期（第81天）类器官和短期（第14天）器官中的相对表达情况。
ExtendDataFig.2膀胱组合体可recapitulate（概述）体内膀胱的组织结构。
A：小鼠和人重组膀胱组合体的实验方案。
B：3D打印、12wellspinning生物反应器的代表性照片。
C：尿路上皮类器官与带基质的重组膀胱类器官的典型图像比较。虚线分界线上皮和间质之间的界限。比例尺、μm。
D、E：免疫荧光分析膀胱类器官（d）或带基质的膀胱类器官（e）。虚线划分上皮和间质（L，腔）之间的边界。比例尺，μm。
F：用免疫荧光方法分析了膀胱组合体（f）和wide-type膀胱（g）。虚线分界线左侧为上皮和间质，右侧为间质和肌肉（L为腔；S为间质；M为肌肉）。比例尺，μm。
H：人膀胱类器官和带基质膀胱类器官体的代表性图像。虚线分界线上皮和间质之间的界限。比例尺，μm。
I：来自P-9良性尿路上皮标本的正常成纤维细胞的代表性图像（左）和由P-9正常成纤维细胞（右）产生的iPSCs的代表性图像。比例尺，μm。
J：人成纤维细胞来源的hiPSCs逐步分化为可收缩的人平滑肌细胞（hSMCs）的实验策略。在逐步分化过程中，显示在指定时间的代表性图像。比例尺，μm。
K：从hiPSCs分化得到的hSMCs在第14天用免疫荧光检测。
ExtendDataFig.3膀胱组合体的SCRNA-seq及功能分析。
A：人细胞系(HULECs)在1天和7天膀胱组合体中的t-SNE图。
B：与人内皮细胞(HULECs)1天和7天膀胱组合体的簇相比，WT内皮细胞簇A3和A5中表达的前15个标记的基因表达热图。膀胱组合体中HULECs的基因表达由同源基因表示(同源基因列表来自ENSEMBLBioMart数据库)。
C：分裂点图显示野生型膀胱内皮细胞簇A3或A5中表达的前15个标记的基因表达，与1天或7天组合体的内皮簇相比（圆圈大小、细胞比例、阴影程度、表达水平）。
D：wide-type膀胱与膀胱组合体在单个细胞类型比例上的比较分析。
E：利用细胞类型特异性前50个基因，对wide-type膀胱、1日龄和7日龄膀胱组合体的不同细胞类型进行层次聚类分析。
F：在wide-type膀胱中表达前15个标记的四个单个细胞群体簇间基因表达的热图表示。
G：从图中得到的1天和7天膀胱组合体中上皮细胞群体的re-clustering（再聚类分析）。Fig.2a分别确定了5个和4个上皮亚簇。
H：展示图g中显示的1天和7天膀胱集合的每个簇的比例。
I：对panelg所示的两簇细胞使用Violin图对每个细胞簇中选定的8个基础和腔标记物进行了分析。
J：用明场图像和免疫荧光分析乙酰胆碱(Ach)或去甲肾上腺素(NA)处理的膀胱组合体。标尺，μm。
K：wide-type膀胱(黑白箭头，紧密连接；L，管腔；UP；尿路上皮斑块)相比，膀胱组合体中紧密连接和尿路上皮斑块的透射电镜(TEM)和免疫染色分析)。标尺，1μm(TEM)或10μm（免疫染色）。
L：免疫染色ZO-1用于人膀胱组合紧密连接(白色箭头，紧密连接；L，管腔)。标尺，20μm。
ExtendDataFig.4膀胱组合体模拟病理生理学，并展示在尿路感染的组织动力学。
A：建立UTI体内和体外模型的示意图。
B：用荧光蛋白AmCyan标记的UTI89被微注入腔内膀胱组合体。标尺，μm。
C、D：用免疫染色法分析了wide-type膀胱(C)和膀胱组合体(D）。标尺，50μm。
E：用免疫染色分析wide-type膀胱和膀胱组合体（白色箭头、浅表细胞内细菌聚集)。标尺，50μm。
F：对KRT5、KRT18和波形蛋白进行免疫染色，分别突出基底上皮细胞、腔内上皮细胞和基质细胞。标尺，μm。
G、H：膀胱组合体重组不同细胞类型的Col1a2CreER；Smofl/fl小鼠(g，wild-typeSmo；h，Smoablated)经免疫染色分析。上皮和基质细胞增殖的定量显示在右侧。Scalebars,μm。
I：彩虹等位基因的示意图表示。在CRE介导的三个lox位点(lox、loxN和loxP)被tamoxifen（TM）诱导后，每个细胞表达EGFP（重组前）或mCerulean、mOrange或mCheery（重组后）。
J：彩虹小鼠TM诱导后，单细胞标记的正常膀胱或膀胱器官体。Scalebars,μm.
K：表达KRT5的基底上皮，体内和体外细胞谱系追踪的实验方案。
L：用四色荧光法分析细菌注射前（UPECday0）和细菌注射后（UPECday7），对象为注射TM的Krt5CreERT2；Rosa26Rainbow/WT小鼠的膀胱，和用4-OHT处理的Krt5CreERT2、Rosa26Rainbow/WT小鼠的膀胱组合体。Scalebars,μm。
M：UTI诱导尿路上皮克隆再生过程的模型图。
ExtendDataFig.5膀胱肿瘤组合体的产生recapitulating（概述）人尿路上皮癌的组织病理学、基因组改变和肿瘤亚型。
A：从8个患者来源的浸润性尿路上皮癌标本中建立了8种膀胱肿瘤类器官。通过HE染色和免疫染色分析肿瘤类器官，标记基底细胞(KRT5)和腔内细胞(KRT18）。Scalebars,μm.。
B-I：腔样标记物(UPK1A、UPK2、ERBB2、FOXA1和GATA3)和基底样标记物(KRT5、KRT14、CDH3和KRT6A)在8个患者来源的膀胱肿瘤类器官中的相对表达。
J：基于基因表达分析的8种膀胱肿瘤类器官分型总结。
K：重组患者来源的膀胱肿瘤组合体的实验方案。
L、M：采用HE染色和免疫染色分析了P-3（基底型）和P-6（管腔型）衍生的肿瘤类器官、肿瘤组合体、Xenograft和亲本肿瘤的组织病理学。Scalebars,μm
N：通过免疫染色分析来自P-1的膀胱肿瘤组合体，以标记肿瘤细胞、CAFs和内皮细胞（箭头、相互连接的区域）。Scalebars,μm。
O：通过使用ImageJ程序测量肿瘤区域来量化肿瘤生长。
P：免疫染色法分析无内皮细胞或有内皮细胞重组的膀胱肿瘤组合体。Scalebars,μm。
Q：亲本肿瘤、肿瘤类器官和肿瘤组合体的WES检测突变的对比分析。
R：用免疫染色法分析亲本肿瘤、晚期肿瘤类器官（晚期类器官）和晚期肿瘤组合体(晚期组合体）。Scalebars,50μm。
S：腔样标记物（UPK1A、UPK2、ERBB2、FOXA1和GATA3)和基底样标记物(KRT5、KRT14、CDH3和KRT6A)在亲本肿瘤，晚期类器官，晚期组合体的表达情况。
ExtendDataFig.63D打印为基础，重组膀胱肿瘤组合体recapitulate（概述）患者来源的尿路上皮癌的病理生理学。
A：基于3D打印的患者来源膀胱肿瘤组合体重建示意图。
B、C：用HE染色和免疫染色分析P-1(B)或P-3(C)系的3D生物打印膀胱肿瘤类器官和组合体。Scalebars,μm。
D、E：用SAG、FK或vehicle对照处理3D生物打印膀胱肿瘤组合体，用免疫染色法对KRT18(管腔样亚型；d)或KRT5(基底样亚型；e)和波形蛋白进行分析，并与膀胱肿瘤类器官进行比较。量化显示肿瘤细胞数量。Scalebars,μm。
F、G：顺铂治疗3D生物打印膀胱肿瘤组合体，用caspase3分析，并与膀胱肿瘤类器官进行比较。量化显示肿瘤细胞凋亡,Scalebars,μm。
H：人ES细胞逐步分化为收缩性hSMCs的实验策略。在逐步分化过程中，在指示时间展示有代表性的图像。Scalebar,μm。
I：用免疫染色法分析了第14天人ES细胞分化的hSMCs。Scalebar,μm。
J：创建包含外肌层的膀胱肿瘤组合体的实验方案。
K：用免疫染色法分析了P-7和P-3中含有外肌层的膀胱肿瘤组合体。虚线划定基质层和肌肉层之间的边界。Scalebar,μm。
ExtendDataFig.7膀胱肿瘤组合体模拟膀胱肿瘤的病理生理学，并显示具有CD8T细胞介导的肿瘤细胞*性。
A：重组小鼠膀胱肿瘤组合体的实验方案。
B：对BBN诱导的小鼠膀胱肿瘤、重组膀胱肿瘤组合体和内源性BBN诱导的小鼠膀胱肿瘤的肿瘤类器官进行了HE染色和免疫染色分析，Scalebars,μm。
C：用免疫染色法分析了SAG、FK或vehicle对照处理的小鼠膀胱肿瘤器官和肿瘤组合体。通过使用ImageJ程序测量肿瘤区域来量化肿瘤生长。Scalebars,μm。
D：产生肿瘤反应T细胞的实验策略。
E：分析CD8T细胞(B-CD11b-TCRβ+CD4-CD8+)的门控策略，如pannelf所示。
F：流式分析肿瘤反应CD8T细胞表达CD69和IFNγ的情况。
G：产生含有肿瘤反应T细胞的膀胱肿瘤组合体的实验策略。
H：通过明场成像（虚线、肿瘤区域）和免疫染色分析含有肿瘤反应T细胞的膀胱肿瘤组合体。Scalebars,μm。
I：系统地发现肿瘤新抗原并在肿瘤组装体平台内测试肿瘤反应性的策略示意图。通过WES检测BBN诱导的小鼠肿瘤的肿瘤特异性突变，并通过应用mutationcallingalgorithms算法(Mutect)进行鉴定。用验证良好的算法(NetMHCpan)预测候选新抗原表位，并根据与H-2-Db和H-2-Kb分子的结合亲和力进行选择。通过增加IFNG表达，验证了所选新抗原特异性T细胞的肿瘤反应性。这些候选的新抗原特异性T细胞被进一步重组，以测试它们在组装体平台内刺激肿瘤特异性T细胞反应的能力。
J：被认为与H-2-Db（左）或H-2-Kb（右)有强烈结合的假设新抗原的列表。列表展示前10位新抗原候选物为突变多肽相对于野生型多肽的结合亲和力。只有一个突变体，LGFSNYPEL(Olfr突变体)被预测与H-2-Db和H-2-Kb都有很强的结合。
K：与突变型-Olfr多肽相比，野生型-Olfr多肽刺激T细胞中Ifng的相对表达情况。
L：用明场图像（虚线、肿瘤区域）和免疫染色分析了含有新抗原反应T细胞的膀胱肿瘤组合。量化显示肿瘤大小和肿瘤细胞凋亡。Scalebars,μm。
ExtendDataFig.8下一代组合体的发展前景模型。
我们的研究提供了一个概念框架，以发展来源于组织干细胞或肿瘤细胞的多层的，有功能的器官，来模拟天然组织的生物学。这些微型组织，组合体，可以作为各种疾病的模型，包括癌症和退行性疾病。利用3D打印技术，该平台可促进建立用于高通量药物筛选或重新定位的体外器官系统，以开发精确和个性化的治疗方法。
ExtendDataFig.9基因操作的肿瘤组合体展示了基底样肿瘤和管腔型肿瘤的染色质accessibility（开放性）和增强子活性的表观基因组景观的差异。
A：基底样肿瘤类器官和管腔型肿瘤类器官用患者来源的CAFS一起重组，然后在旋转生物反应器中摇动培养。
B：基底样肿瘤类器官通过感染慢病*过表达FOXA1，和CAFS一起重组。管腔型肿瘤类器官通过感染慢病*敲除FOXA1，用CAF重组。
C：和CAFs一起重组的基底样肿瘤类器官，被操纵过度表达BMP4和BMP5。和CAFs一起重组的管腔型肿瘤类器官，被操纵敲除BMP4和BMP5。
D：和CAFs一起重组的基底样肿瘤类器官通过慢病*敲除FOXA1，使其过表达BMP4和BMP5，并通过摇动培养。和CAFs一起重组的管腔型肿瘤类器官感染慢病*过表达FOXA1，并通过摇动培养。
E、F：用RT-qPCR方法分析FOXA1在FOXA1过表达基底样肿瘤类器官中的相对表达。KO，敲除；OE，过表达。
G、H：用RT-qPCR方法分析FOXA1在FOXA1基因敲除管腔型肿瘤类器官中的相对表达。
I、J：采用RT-qPCR技术分析了BMP4/BMP5过表达CAFs中的BMP4或BMP5的相对表达情况。
K、L：用RT-qPCR技术分析了BMP4/BMP5基因敲除CAFs中BMP4或BMP5的相对表达情况。
M：敲除BMP4、BMP5和FOXA1的guideRNA和靶基因序列(PAM序列用红色标记)。
N、P：四个组合体(L1=P-1；L2=P-6；B1=P-2；B2=P-3)中腔内(N)或基底(P)染色质开放性/H3K27ac信号增加区域的热图。每行；单独行(n=4)。每列；单个区域(centre+/?5Kb)。
O、Q：根据给定峰的位置，Pie图显示了在管腔样(O)或基底样(Q)中染色质开放性/H3K27ac信号增加的区域的基因组注释。转录起始位点的TSS，“?1-kbto+-bp“。转录终止位点的TTS，“?-bpto+1-Kb”。
R：管腔样中，前5名含量最丰富的全新基元，在区域内转录因子最佳匹配的结合基元，并且增加染色质开放性/H3K27ac信号的。最丰富的基元表现出与Forkheadbox转录因子结合基元具有很高的相似性。
S：通过ATAC-seq，H3K27acCHIP-seq和FOXA1CHIP-seq的结果，指示样本在ISX位点的区域。
T：管腔样的增加染色质开放性/H3K27ac信号相关的基因的通路分析。只有排名前10的GOterms按其意义展示。
ExtendDataFig.10FOXA1介导的增强子重编程赋予尿路上皮癌的肿瘤亚型可塑性，通过FOXA1-BMP-hedgehog信号反馈轴在上皮性肿瘤和间质之间的差异。
A、C：来自指定样品的GAIN/LOSSregions/genes的ATAC-seq、H3K27acCHIP-seq和RNA-seq的热图。对ATAC-seq和H3K27acChIP-seq进行了Hierarchicalclustering（分级聚类）。
B、D：指示样品的GSEA，评估GAIN基因（左)和细胞分化特征基因(右)的差异富集）。NES，归一化富集评分。展示标准p值。
E、F：基地样肿瘤类器官B1(E)和B2(F)中FOXA1的相对表达，用BMP4、BMP5或BMP4和BMP5共同处理。数据是平均±s.e.m。
G、H：通过ATAC-seq，H3K27acCHIP-seq和FOXA1CHIP-seq的结果，指示样本在IRX2位点的区域。
I、J：用BASE47和MDACC分类器分析了所指示样品的分子亚型。热图显示由管腔样和基底样分类基因系统组织后的归一化基因表达谱。
K、L：热图表示无监督多级聚类，数据来自ATAC-seq(K)或H3K27acCHIP-seq(L)，在ExtendedDataFig.9a–d每个实验的总结中。样品的聚类是基于Spearman相关系数单联聚类法。
M：从RNA-seq数据中分析肿瘤组合体在每个实验中的主要部分，总结在ExtendedDataFig.9a–d。
N：在管腔样中，富集的染色质开放性/H3K27ac信号增加的区域基元的展示。
O：在管腔样中，前5名含量最丰富的全新基元，在区域内与转录因子最佳匹配的结合基元，并且是增加染色质开放性/H3K27ac信号的。最丰富的基元与AP-1转录因子结合基元具有很高的相似性。
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