北京白癜风公益活动 http://baijiahao.baidu.com/s?id=1700352152225524141&wfr=spider&for=pc这项研究的意义
研究表明前列腺癌内的神经密度和前列腺的进展和预后有关，但是目前没有方法能够将前列腺癌内的神经密度进行可视化，这项研究就设计了相关分子和方法用于前列腺癌内的神经现象。通过了解前列腺癌内的神经密度来评估前列腺癌患者的预后和进展。
原文链接（ScienceAdvances影响因子13.一区）：
YouH,ShangW,MinX,etal.Sightandswitchoff:Nervedensityvisualizationforinterventionstargetingnervesinprostatecancer.SciAdv.;6(6):eaax.PublishedFeb5.doi:10./sciadv.aax
实验总概
研究中设计一种普萘洛尔共轭超顺磁性氧化铁（(SPIO)）神经肽纳米粒子（PSNNPs），这种粒子能够以很高的特异性和敏感性显示前列腺癌内的神经密度。
图一：PSNNPs合成示意图。用顺磁性氧化铁离子结合普萘洛尔和NP41。其各自作用：
顺磁性氧化铁能够实现MRI和MPI的双重成像的造影剂，且为纳米粒子，未来有临床应用的前景；普萘洛尔是β受体阻滞剂，可以阻断前列腺癌内神经的分泌，可能能够有抑制前列腺癌生长的作用；NP41是一种能够与神经外膜特异性结合的多肽，能够起到定位导航的作用，帮助粒子准确识别神经。
为了能够验证这种离子的作用，文章用了核磁共振成像（MRI）和磁粒子显像成像（MPI）进行了验证评估。核磁已经应用于临床，MPI是一种比较新的技术，而且有应用到临床的潜质。
实验可行性相关信息支持
要想实现前列腺癌内的神经显像，就需要能够找到能够对神经染色的材料靶点。本研究用的是一种能够对周围神经细胞表面结合的神经肽NP41，NP41是利用噬菌体展示技术筛选出来的一种神经肽，序列为NTQTLAKAPEHT。经过研究表明laminin-和-是NP41结合的靶标蛋白。
只需要将相应的发光材料与NP41相结合，那么发光材料就会随着NP41结合到神经上，从而将神经染色。而且NP41对神经的染色不会因为神经的断裂而消失，这就意味着如果在术中不小心将神经切断了，是可以被发现的。
PSNNPs将NP41作为导航，另外还结合了两种分子：
结合超顺磁性氧化铁（(SPIO)），这种材料能够同时在MRI和MPI下成像，其中MPI成像也是这项研究的一个亮点之一，因为这项技术有可能在未来用于临床检查，丰富了研究的内容。这两种检测相结合就能够更准确地测到前列腺癌内的神经密度。这个分子还结合了普萘洛尔（propranolol），结合β受体阻滞剂的目的是为了实现前列腺癌治疗，因为有研究表明β受体阻滞剂对前列腺癌的治疗有帮助，在实验中能够实现一箭双雕。
图二：整个研究的总概括和示意图。MRI和MPI成像显示的神经密度图具有高度的敏感性和特异性，并且β-阻滞剂普萘洛尔可有效地抑制PCa进展。
具体实验思路和步骤
一、构建动物模型和对前列腺癌内神经的染色
首先第一步就是构建一个含有神经的前列腺癌的模型，然后对这个模型进行验证，也就是要证明构建的前列腺癌是前列腺癌，前列腺癌内的神经是神经，而不是其他的。
小鼠模型模仿的是自然前列腺的癌微环境，在雄性小鼠腹侧接种PC-3luc细胞后11周后能够辨认出前列腺癌内的神经。
用于确定神经的相关指标的染色：
络氨酸羟化酶（TH）对肾上腺神能神经纤维进行染色；囊状乙酰胆碱转运体（VACh-T）对胆碱能神经纤维进行染色；用高/低分子量神经丝蛋白（NF-H/L）对神经特异性细胞骨架进行染色。蛋白免疫印迹（WesternBlot）分析比较正常组织和前列腺癌组织中NP41目标蛋白（神经层粘蛋白）。
图三：
①在小鼠腹侧注射PC-3luc细胞11周后，Balb/c裸鼠体模型照片；
②原发前列腺癌标本照片；
③原发前列腺肿瘤的HE染色；
④TH、⑤Vacht、⑥NF-H和⑦NF-L的免疫荧光染色证实了前列腺癌内的神经元。DAPI(4‘，6-二氨基-2-苯基吲哚)，蓝色；TH，Vacht，NF-H和NF-L，红色。比例尺，50um。
图四A
图四B
图四：前列腺肿瘤组织和正常前列腺组织中神经层粘连蛋白（neurallaminins）表达的Westernblot图像。肿瘤内的Lam相关蛋白表达更高。
图五：免疫荧光染色TH(C),VAChT(D),NF-H(E),和NF-L(F)分别与NP41结合的照片。比例尺：um。
图六：laminin-α4(Lamα4,G),laminin-β2(Lamβ2,H),laminin-α2(Lamα2,I),laminin-β1(Lamβ1,J),andlaminin-γ1(Lamγ1,K)与NP41结合的荧光显像。比例尺,um。
然后对Cy7-NP41进行表征。研究者用小分子花菁7（Cy7）做成纳米探针Cy7-NP41，作为参考标准，用于验证体内和体外NP41与前列腺癌神经的结合。对Cy7-NP41的量和质的分析表明Cy7-NP41最佳荧光成像浓度为40uM。质谱分析表明Cy7–NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和NP41能够用稳定共轭。用吸收峰、荧光激发和发射光谱以及血清稳定性监测表明了Cy7-NP41的出色光学性能。
实验表明Cy7-NP41对PC-3luc细胞和DU-luc细胞无明显的细胞*作用，表明Cy7-NP41具有进一步实验的优越性，可以用Cy7-NP41对原位PCa神经进行体内和体外光学成像。
图七：对Cy7-NP41的表征。
（A）在不同浓度下Cy7-NP41的荧光图像。
（B）Cy7-NP41的荧光强度随着浓度的增加而增加，直至40μM，此后荧光强度随浓度的增加而降低。
（C）Cy7-NP41的质谱分析。
（D）Cy7-NP41和Cy7的紫外可见吸收光谱。Cy7-NP41的（E）激发和（F）发射光谱。
（G）Cy7-NP41的荧光血清稳定性。
（H）用不同浓度的Cy7-NP41孵育的PC-3细胞和DU-细胞的细胞生存力。
最后在体内验证NP41的靶向性。Cy7-NP41在瘤区逐渐积聚，注射后8h达高峰，最大肿瘤/正常组织比值(TNR)为6.1±0.28，是游离Cy7(2.2±0.13)的3倍(P0.01)。注射后48小时解剖的肿瘤和主要器官进一步对比，表明了Cy7-NP41在肿瘤部位的积聚，并表明了NP41的靶向性。Cy7-NP41对比游离的Cy7可以发现，Cy7-NP41可以结合到肿瘤区域丰富的神经上，从而使神经可视化成为可能。具体内容如图八所示。
图八：体内靶向NP41。
（A）Cy7-NP41和游离Cy7的生物分布。黑色虚线圆圈表示原发前列腺癌的神经密度。
（B）体内原发前列腺癌的Cy7-NP41的FLI（1）和BLI（2）的三维成像。
（C）比较Cy7-NP41和游离Cy7在不同时间点的TNR。
（D）使用Cy7-NP41后，体内原位前列腺癌（1）和裸露的肿瘤组织（2）的FLI。黑色虚线圆圈表示原位前列腺癌的神经密度。
（E）前列腺肿瘤和主要器官的离体的FLI。T=前列腺肿瘤，H=心脏，Li=肝脏，S=脾脏，Lu=肺，K=肾脏，In=肠。
（F）对前列腺肿瘤和主要器官的荧光强度的定量分析。
（G）TH，VAChT，NF-H和NF-L的相应免疫荧光染色。DAPI，蓝色；TH，VAChT，NF-H和NF-L，红色。
荧光强度的单位[p/s/cm/sr]/[W/cm]×.*P0.05,**P0.01,****P0.。比例尺，50μm。误差线代表SEM（每组n＝3）。
二、高特异性和敏感性对前列腺癌神经密度进行可视化
下一步就是要合成我们需要的PSNNPs，然后对PSNNPs进行表征，合成的过程图详见图一。
PSNNPs具有高度的单分散性和均匀性，平均粒径为10±0.4nm，水化颗粒尺寸为23±6nm。本研究对PSNPs（没有结合NP41的粒子）和PSNNPs（结合了NP41的粒子）的一些特性进行了对比。
UV-vis吸收光谱显示，在PSNNPs溶液中，NP41的标记效率为87%。如图九E和图十。
并且还对PSNNPs溶液不同的浓度、pH以及温度进行MRI和MPI进行了表征分析，包括普萘洛尔的释放性能。从PSNNPs释放普萘洛尔的时间和pH依赖性表明，酸性肿瘤微环境可以促进从PSNNPs释放心得安。这些结果提示了PSN纳米粒在前列腺癌中的治疗潜力。
有关以上提及的PSNNPs相关特性，详见下图：
图九：对PSNNPs的准备和表征。
(B)左：NP41标记前的PSNPs透射电镜图像(TEM)；右：NP41标记后的PSNNPs的TEM图像。插图显示了PSNNPs溶液的外观。
(C)PSNPs和PSNNPs的水化的粒子直径对比图。
(D)PSNPs和PSNNPs的Zeta电位对比。
(E)溶液1和2的UV-vis吸收光谱对比。溶液1：多肽标记前的PSNPs的溶液。溶液2：多肽标记后的上清液。
(F)不同浓度PSNNPs的T2加权MRI图像；(G)PSNNPs的T2弛豫速率。红色虚线圆圈显示随着PSNNPs浓度的增加，MRI图像呈黑色。
(H)不同浓度PSNNPs的MPI图像；（I）不同浓度PSNNPs的MPI信号。
(J)PSNNPs的室温磁化曲线。
(K)HPLC分析在pH6.0和7.4的环境下，PSNNPs的在缓冲液中的普萘洛尔体外释放情况。
图十：肽浓度与nm处的光吸收峰之间的相关性分析
在体外对PSNNPs进行表征后，就可以在体内验证其对前列腺癌内神经的敏感性和特异性了。
研究通过尾静脉给小鼠静脉注射PSNPs和PSNNPs，并监测它们在不同时间点的分布。注射PSNNPs后6h，原位PCa的T2加权像(T2WI)信号强度降低。注射PSNNPs24小时后，肿瘤区域的T2WI信号强度明显降低。
PSNNPs没有突出显示整个肿瘤，表明PSNNPs特异性地结合到与PCa进展相关的神经上，从而使其可视化。
这里需要注意的是，PSNPs并没有出现这种效果。因为PSNPs直径大于6nm，由肝脏、肠道和脾脏代谢，不能穿透肿瘤微环境；然而，PSNNPs由于NP41的存在，可以主动靶前列腺癌中的神经组织。各种结果表明PSNNPs有助于在活体内对PCa的神经密度可以进行高度敏感和特异性的可视化。
详细实验结果见下图：
图十一：PSNNPs与PSNPs的成像差异。
(A)全身注射PSNNPs和PSNPs前后不同时间点的PCa神经密度的T2加权MRI图像。红色虚线圆圈表示原位PCa的神经密度。
(B)全身注射PSNNPs和PSNPs后24h，获得PCa神经密度的MPI图像。
(C)在图(A)对应时间点对PSNNPs和PSNPs组中的TNR进行量化。两种纳米探针注射后24小时和48小时的TNR值有显著性差异(P=0.和P=0.)。
(D)在图(B)对应时间点的PSNNPs和PSNPs组中的MPI信号量化。注射PSNNPs和PSNPs后24小时MPI信号值有显著性差异(P0.)。
（E)静脉注射PSNNPs和PSNPs后，主要器官(肝、脾、肾)和肿瘤的核固红和普鲁士蓝双重染色图像。*P0..05，**P0.01，*P0.01，t检验。比例尺，50um。
三、验证PSNNPs区分前列腺癌神经高密度和低密度的能力
前文已经对PSNNPs的各种性质做了表征和分析，并且表明了其可以在前列腺癌内的神经进行特异性显像，但是这种成像能否对前列腺癌内的神经密度进行准确的区分？这一点还是不够清楚的。但这一点也是非常重要的，如果运用在临床，那么就可以根据这个预测患者的预后。
本研究用药物和手术两种方式建立了动物模型，即高密度和低密度前列腺癌模型。
以药物方法为分别使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和神经*性药物6-羟基多巴胺(6OHDA)进行处理。
由于6OHDA介导的肾上腺素能神经元的选择性破坏，抑制了PCA的神经密度，从而影响了原位PCA的进展。
相反，PBS不影响PCa中的神经发生，而且会导致高神经密度的原位PCA。
6OHDA处理组小鼠的增殖指数(Ki-67)低于PBS处理组(P0.01)，细胞增殖指数(Ki-67)低于PBS处理组(P0.01)。通过实验表明药物构建模型很成功，详细如下图：
图十二：通过PBS和6OHDA分别构建的具有高、低神经密度的原位PCa。
（A）在用6OHDA-去神经的小鼠中和PBS处理的组中，异种移植后1到8周，对前列腺中异种移植物的生物发光强度进行系列定量。
（B）在PBS和6OHDA处理的小鼠中（第8周）对包括TH，VAChT，NF-H和NF-L在内的神经密度进行定量分析。
（C）在PBS和6OHDA处理的小鼠中测ki-67指数。
药物模型建立成功后，就可以用PSNNPs对建立的模型进行染色，来验证PSNNPs能否区分高、低密度的不同。所用的思路依然是注射PSNNPs后24小时用MRI和MPI进行成像，观察成像的结果，如果能够显示，那么两种不同药物处理组的现象是完全不同的。
并且研究者还分析了这两种模型的Ki-67,同时验证了肿瘤的增殖能力和神经密度的关系。这样就将肿瘤高增殖与MRI和MPI图像建立了关系，通过影像学实现了观察肿瘤增殖的情况。
详细见下图：
图十三：PSNNPs区分药物诱导后的PCa高密度和低密度神经分布。
(A和B)分别是PBS和6OHDA处理小鼠全身注射PSNNPs后24小时的MRI图像(A)和MPI图像(B)。红色虚线圆圈表示原位PCa的神经密度。
(C和D)是对(A)和(B)对应时间点的TNR(C)和MPI信号(D)的量化到。
(E)肿瘤的核固红和普鲁士蓝双重染色图像，比较PBS和6OHDA处理的小鼠PSNNPs的积
(F)PBS和6OHDA处理小鼠的TH、VACHT、NF-H和NF-L的免疫荧光图像。DAPI：蓝色；TH,VACHT,NF-H,和NF-L：红色。
(G)PBS和6OHDA处理小鼠的Ki-67的免疫组织化学图像。
(H)TNR与TH、Vacht、NF-H、NF-L、Ki-67指数的Pearson相关分析。
(I)MPI信号与TH、Vacht、NF-H、NF-L、Ki-67指数的Pearson相关分析。
(J)神经密度与Ki-67指数的Pearson相关分析。
但是这些还是不够的，除了从病理角度来验证，作者还用荧光成像（FLI）继续验证。
实验结果表明荧光强度与TH、NF-H、NF-L及Ki-67指数呈显著正相关(P0.01)，这些和前面的工作都是相符合的，但是，VAChT染色显示荧光强度与神经密度无相关性(P=0.，R=0.；S5F)。
因此，研究者继续建立更真实的PCa神经微环境的PCa模型，以确定PSNNPs是否真的能够区分PCa神经的高密度和低密度。
有关这次的验证，详细内容如下图：
图十四：PBS或6OHDA处理的小鼠中PCa神经密度的FLI图像。
（A）PBS或6OHDA处理的小鼠的BLI（左）和FLI（右）。黑色虚线圆圈表示原位前列腺癌的神经密度。
（B）在PBS和6OHDA处理的小鼠中TH，VAChT，NF-H和NF-L的免疫荧光图像。DAPI，蓝色；TH，VAChT，NF-H和NF-L，红色。
（C）在PBS和6OHDA处理的小鼠中Ki-67的免疫组织化学图像。
（D）在PBS和6OHDA处理的小鼠中荧光强度的定量。
（E-I）荧光强度与TH（E），VAChT（F），NF-H（G），NFL（H）和Ki-67指数（I）之间的Pearson相关分析。
那么下面的步骤就是从手术方面继续建立模型来验证。主要方法就是手术切断的腹下神经(HGNx)的小鼠进行原位PCa植入，另外对照组用假手术。与假手术神经完整的小鼠相比，外科去神经手术抑制了PCa进展。病理结果的定量分析表明，高、低神经密度的原位PCa模型均已成功建立。
手术模型最后也验证了PSNNPs能够区分不同神经密度的前列腺癌模型，特别是VAChT（F）与荧光强度的关系也得到了验证。具体实验结果如下：
图十五：手术切断神经相关病理及Ki-67方面的验证，结果和药物一致，不详细叙述。
图十六：手术切断神经之后的FLI强度方面的验证，表明了VAChT(F)与荧光强度也有关，其他结果与药物模型一致。
最后结论是在高神经密度和低神经密度的PCa小鼠中，PSNNPs注射的MRI和MPI与FLI注射Cy7-NP41的结果是一致的。也就是可以用PSNNPs的MRI或MPI来预测前列腺癌内神经的密度，且能预测预后。
四、PSNNPs通过神经阻滞剂抑制PCA进展
前面的内容以及成功表述了PSNNPs的成像能力，但是这个分子上还有一个普萘洛尔，为了是抑制前列腺癌内神经的β受体，了解抑制以后能否抑制前列腺癌的生长，达到治疗的目的。
这个实验设计的思路很简单，就是比较PBS、SNNPs、游离普萘洛尔和PSNNPs治疗的小鼠的存活率，以探讨PSNNPs是否改善了患有PCA的小鼠的存活率。
最后结果表明用PSNNPs处理的小鼠的存活率明显高于用PBS，SNNPs和游离普萘洛尔处理组，而PBS，SNNPs和游离心得安组的存活率相似。
作者还对PSNNPs相关的生物*性进行了验证，小鼠模型中目前是安全的。
具体实验数据图片如下：
图十七（1）
图十七（2）
图十七：PSNNPs抑制原位PCA的发生。将PC-3luc细胞注射于Balb/c裸鼠前列腺腹侧，于第0天形成原位PCa。10d后，将小鼠分为PBS组、SNNPs组、游离心得安(P)组和PSNNPs组。小鼠全身给药6次。
(A)体内生物发光图像显示原位PC-3luc细胞异种移植后第14、23、31和45天出现原位PCa。
(B)第45天原位前列腺肿瘤(左)和淋巴结(右)图像。
(C)组内原位前列腺肿瘤(左)和淋巴结(右)HE染色切片。
(D)TUNEL检测各组别肿瘤中的凋亡细胞。
(E)前列腺异种移植物体内生物发光强度的连续定量。
(F)各组小鼠存活曲线，采用Kaplan-Meier法和log-ranch检验。
(G)治疗过程中小鼠体重的变化。
(H)治疗后各指标组原位前列腺肿瘤中凋亡TUNEL+细胞的定量。
(I)治疗后各指标组TH、VAChT、NF-H、NF-L的免疫荧光图像。
(J)治疗后各指标组Ki-67免疫组化图像。
(K)TH、Vacht、NF-H、NF-L的神经密度定量。
(L)Ki-67指数的量化。
(M)治疗后各种LAM蛋白的免疫荧光图像。
(N)对LAM各种板层粘连蛋白密度进行了定量测定。
最后是对PSNNPs生物*性的验证。
图十八：在健康小鼠中静脉注射后，PSNNPs的急性，亚慢性和慢性*性评估。
（A-C）在急性（A），亚慢性（B）和慢性（C）用PBS，SNNP，P和PSNNP处理的小鼠中确定了血清生化指标。重要的心脏，肝脏和肾脏功能指标包括丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），总蛋白（TP），白蛋白（ALB），球蛋白（GLB），肌酸激酶（CK），L-乳酸脱氢酶（LDH）-L），尿素，肌酐（CREA）和尿酸（UA）。
（D-F）不同处理后，在急性期（D），亚慢性期（E）和慢性期（F）采集主要器官（脑，心脏，肺，肝，脾和肾）的代表性H＆E染色。比例尺，μm。误差棒代表SEM（每组n=5）。
图十九：PSNNPs全身给药六次后对健康小鼠神经功能的评估。
（A-D）测量PSNNP和PBS后腹侧前列腺结合蛋白（PBP）水平的腹侧前列腺重量（A），腹侧前列腺DNA测定（B），表达的蛋白质印迹（C）和定量分析（D）治疗。腹侧前列腺重量，DNA测定和PBP表达用于反映前列腺正常神经支配。
（E-G）服用PSNNP和PBS后的超声心动图测量。左室射血分数（％），左心室射血分数（％）；LVEDd，左心室舒张末期直径；LVESd，左心室末端收缩期直径；LVEF（％）=（LVEDV－LVESV）/LVEDV×％；LVEDV：左心室舒张末期容积；LVESV：左心室收缩末期容积。误差棒代表SEM（每组n=5）。
图二十：PSNNPs全身给药六次后评估健康小鼠神经标志物的表达。
（A-D）在代表性的正常组织（大脑，心脏，肺，胃，肠，肝脏，胰腺，脾脏，脾脏，脏器等）中评估TH（A），VAChT（B），NF-H（C）和NFL（D）的表达。肾上腺，肾，正常前列腺组织和膀胱）。
